新疆多民族地区三阴性乳腺癌BRCA1基因突变分析

刘晓丹，吴 涛，杜 露，杨 亮，王 斌，吐鲁洪·沙吾列，赵 倩，迪力夏提·金斯汗，朱丽萍

摘要：目的研究新疆多民族地区三阴性乳腺癌（TNBC）BRCA1基因的突变情况及突变者与未突变者临床、病理组织特征的差异方法以新疆多民族地区130例TNBC患者为研究对象，从静脉血提取基因组DNA，采用PCR联合直接测序法检测BRCA1基因突变情况结果130例TNBC患者BRCA1突变率为17．7%（23／130），其中汉族与少数民族TNBC患者BRCA1突变率分别为20．5%（17／83）、12．8%（6／47），差异无统计学意义（χ2＝1．856，P＝0．869）。130例TNBC患者中发现23例BRCA1突变的19个位点，其中8个为新发现的位点；4个BRCA1基因突变“热点”；此外还发现了9例（6．9%，9／130）致病性突变，5例无义突变，4例移码突变。早发性TNBC组BRCA1突变率28．3%（13／46）高于晚发性TNBC组11．9%（10／84），差异有统计学意义（χ2＝5．460，P＜0．05）。BRCA1基因突变组与BRCA1基因未突变组相比，发病年龄早，腋窝淋巴结转移率高，TNM分期晚，差异均有统计学意义（P＜0．05）结论新疆多民族地区TNBC患者BRCA1基因突变率高；突变者与未突变者相比，存在临床病理组织差异。

关键词：三阴性乳腺癌；BRCA1基因；突变；DNA序列测定；临床病理特征

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor-2，HER-2）表达均为阴性的乳腺癌，占乳腺癌总数的10%～17%［1］。TNBC因缺乏内分泌和分子靶向治疗，主要治疗为化疗，但疗效不佳，预后差［2］。BRCA1基因是重要的抑癌基因，其结构和功能的异常与乳腺癌的发生密切相关［3］。BRCA1相关性乳腺癌中TNBC占48%［4］，表明BRCA1基因的破坏是TNBC发展的关键步骤。该研究通过对新疆多民族地区130例TNBC患者BRCA1基因进行检测，以研究其突变情况和相关的临床、病理组织特征。

1 材料与方法

1．1 病例资料选取2012年4月～2014年1月新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科收治的经病理确诊，符合TNBC标准的女性乳腺癌患者130例，其中汉族83例，少数民族47例。发病年龄26～73（44．83±11．18）岁。均首次诊断为原发性乳腺癌，既往无其他肿瘤史。将年龄≤35岁和＞35岁TNBC患者分为早发性TNBC组（n＝46）和晚发性TNBC组（n＝84）。按BRCA1基因突变与否分为BRCA1基因突变组（n＝23）与BRCA1基因未突变组（n＝107），所有入组患者根据伦理委员会要求签署知情同意。抽取外周静脉血，置入5 ml含EDTAK2抗凝的真空采血管中，放入－80℃冰箱保存。

1．2 主要试剂与器材血液基因组DNA提取系统（非离心柱型）、Pfu DNA Polymerase、Super Pure dNTP Mix（北京天根公司）；琼脂糖、50×TAE（上海生工公司）；Marker DL2000、6×Loading Buffer（大连TAKARA公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器制造厂）；核酸蛋白定量仪（北京凯奥公司）；电泳仪电源、电泳槽（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统（美国UVP公司）；梯度PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

1．3 实验方法

1．3．1 基因组DNA提取 应用血液基因组DNA提取系统按试剂盒说明提取DNA，并电泳、保存。

1．3．2 PCR扩增 PCR反应体系：10×Pfu Buffer 3 μl，dNTP Mix（10 mmol／L）0．6 μl，Primer F（10 μmol／L）0．6 μl，Primer R（10 μmol／L）0．6 μl，Template 0．6 μl，Pfu DNA Polymerase 0．3 μl，ddH2O224．3 μl，相对应的DNA为50 ng，总反应体系为30 μl。PCR程序：95℃5 min，95℃30 s，退火温度30 s，72℃60 s，40个循环，然后72℃延伸5 min，4℃保存，引物序列和退火温度见表1。

1．3．3 直接测序与分析 取PCR扩增产物5 μl在2．0%琼脂糖凝胶电泳确定为单一亮条带，取目的片段送至乌鲁木齐欧易生物医学科技有限公司进行正反双向测序，将测序结果与GenBank中的BRCA1标准序列（NM＿007300．3）进行比对，判断有无基因突变，再将突变的位点在乳腺癌信息中心网站数据库（breast cancer information core，BIC）上作对照，判定是核苷酸多态性位点、致病性突变位点，还是新发现的突变位点。根据HUGO推荐的规则对碱基插入和丢失进行命名。

表1 部分PCR引物序列和退火温度

1．4 ER、PR、HER-2检测方法和结果判定患者均采用PV9000法检测ER、PR、Her-2的表达。ER、PR以细胞核内有棕色颗粒者视为阳性细胞，着色阳性细胞数＞10%视为阳性；Her-2以＞10%细胞膜出现连续性的棕黄色表达视为阳性，10%～30%为（＋），31%～50%为（＋＋），＞50%为（＋＋＋）。对于Her-2（＋＋）者再行荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）法检测确定扩增情况。

1．5 统计学处理采用SPSS 17．0软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，计数资料以n或%表示，组间率的比较采用χ2检验。

2 结果

2．1 BRCA1基因突变情况130例新疆TNBC中有23例发生BRCA1基因突变，突变率17．7%，其中汉族、少数民族患者突变率分别为20．5%（17／83）、12．8%（6／47）；汉族突变率稍高于少数民族，但差异无统计学意义（χ2＝1．856，P＝0．869）。此外7例（5．4%）BRCA1致病性突变，均为汉族，2例患者有家族史。见表2。

表2 130例TNBC患者BRCA1突变检测结果

GenBank参照：BRCA1，U14680；Glu：谷氨酸；Lys：赖氨酸；Gln：谷氨酰胺；Val：缬氨酸；Met：甲硫氨酸；Gly：甘氨酸；Asp：天冬氨酸；Tyr：酪氨酸；His：组氨酸；Thr：苏氨酸；Arg：精氨酸；Asn：天冬酰胺；Leu：亮氨酸；Pro：脯氨酸；Ala：丙氨酸；IIe：异亮氨酸；Phe：苯丙氨酸；Trp：色氨酸；IVS16＋1G＞A：在第16号内含子区基因拼接点向下1 bp的位置碱基G变为A；BIC：乳腺癌信息中心数据库；“－”意义不清楚

2．2 BRCA1基因突变位点130例新疆TNBC患者中23例BRCA1突变19个位点，位于Exon10共13个（6个MS，4个NS，3个FS），其余6个分别在2、5、16、24号外显子及16号内含子；其中有8个位点在BIC中未有报道，为新发现的位点。见表2、图1。9例BRCA1致病性突变（5例NS，4例FS）中7个均在10号外显子，剩余2个分别在2号、24号外显子；其中4个位点（Exon2 34C＞T、Exon10 3294delT、2073delA、1234G＞A）在BIC中未有报道，为新发现的位点。此外还发现了4个BRCA1基因突变“热点”：Exon2 25G＞A，Exon10 2566T＞C、2077G＞A和Exon5 212＋1G＞T。见表2。

图1 部分BRCA1基因序列测定

A：BRCA1-Exon2 25GA；B：BRCA1基因突变组-Exon2 25GG

2．3 BRCA1基因突变临床病理特征在130例新疆TNBC中，BRCA1基因突变组在年龄≤35岁的比例56．5%（13／23）高于BRCA1基因未突变组30．8%（33／107），差异有统计学意义（χ2＝5．460，P＝0．019）。腋窝淋巴结转移率在BRCA1基因突变组60．9%（14／23）高于BRCA1基因未突变组36．4%（39／107），差异有统计学意义（χ2＝4．675，P＝0．031）。BRCA1基因突变组较BRCA1基因未突变组在TNM分期晚，BRCA1基因突变组在3、4期比例为52．2%（12／23）高于BRCA1基因未突变组27．1%（29／107），差异有统计学意义（χ2＝8．370，P＝0．039）。但在民族、肿瘤大小、组织学分级、病理类型以及Ki-67方面，BRCA1基因突变组与BRCA1基因未突变组比较差异无统计学意义。早发性TNBC（≤35岁）组BRCA1突变率28．3%（13／46）明显高于晚发性TNBC组11．9%（10／84），差异有统计学意义（χ2＝5．460，P＝0．019）。见表3。

表3 130例TNBC患者BRCA1基因突变组与未突变组的临床病理特征［n（%）］

3 讨论

健康人群中BRCA1突变率＜0．5%。Kwon et al［5］报道不同的研究人群TNBC中BRCA1突变率为11%～38%；本研究显示新疆地区130例TNBC患者BRCA1突变率为17．7%（23／130），与文献［6］报道基本一致。Lidereau et al［7］研究70例法国妇女≤35岁侵袭性乳腺癌中BRCA1的基因突变，显示BRCA1突变率在ER阴性、高级别肿瘤的患者（28．6%）显著高于无这些特征的患者（3．6%）。而国内薛伟男等［9］研究92例黑龙江省家族性和早发性乳腺癌BRCA1突变率为7．6%。本研究显示早发性TNBC组BRCA1突变率为28．3%（13／46），与国外同类报道［7］基本一致，高于国内同类报道［8］，提示BRCA1突变可能与新疆地区早发性TNBC密切相关。这也支持NCCN指南关于＜50岁的TNBC患者应当做BRCA基因突变检测的建议。通过对BRCA基因检测能够降低23%的患者对侧发生乳腺癌风险，降低41%患者再次患卵巢癌的风险［9］。

本研究显示的4个BRCA1基因突变“热点”，可能为新疆地区遗传易感位点；此外还发现8个在BIC中未报道的位点，丰富了中国BRCA1突变携带谱。这些突变可能与新疆地区TNBC患者的地域或种族不同有关系。但并没有表明中国人群的“始祖位点”，可能样本量较少，因此未来还需要对不同民族、不同地域、不同遗传背景的群体进行大样本研究。筛查BRCA1基因突变对于乳腺癌患病风险评估、早期诊断及基因治疗均具有重要的临床意义，但费用较高而无法在临床上普及，本研究表明的BRCA1基因突变的“热点”也许可以为以后新疆多民地区开展BRCA1基因筛选工作提供帮助，降低成本，提高检测率。

Levanat et al［10］报道BRCA1相关性乳腺癌具有与散发性乳腺癌完全不同的病理组织学特征，两者相比，BRCA1基因突变组具有髓样癌及Luminal A亚型比例高、肿瘤细胞分级高等特点。但本研究中23例BRCA1基因突变组TNBC病理类型多为浸润性导管癌87．0%（20／23），仅3例髓样癌，与BRCA1基因未突变组相比组织学分级无统计学意义，这与西方患者病理组织特点不同。但本研究中BRCA1基因突变组具有发病年龄早、腋窝淋巴结转移率高以及TNM分期晚的特点。与杨云振等［11］报道的汉族散发性乳腺癌患者BRCA1基因突变研究组织病理学特点一致。通过本研究显示，新疆地区TNBC患者BRCA1基因突变率较高，BRCA1基因突变组与BRCA1基因未突变组相比，发病年龄早且淋巴结转移率高、TNM分期较晚，提示预后较差，应考虑个体化治疗。

参考文献：

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［3］ Narod S A，Salmena L．BRCA1 and BRCA2 mutations and breast cancer［J］．Discov Med，2011，12（66）：445－53．

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［5］ Kwon J S，Gutierrez-Barrera A M，Young D，et al．Expanding the criteria for BRCA mutation testing in breast cancer survivors［J］．J Clin Oncol，2010，28（27）：4214－20．

［6］ 吴 涛，王秀梅，欧江华，等．新疆维吾尔自治区高风险三阴性乳腺癌30例BRCA基因突变及临床病理特征对比［J］．肿瘤研究与临床，2013，25（11）：738－41．

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［8］ 薛伟男，王劲松，宋燕妮，等．家族性和早发性乳腺癌BRCA1基因突变分析［J］．实用肿瘤学杂志，2010，24（5）：408－12．

［9］ King T A，Sakr R，Patil S，et al．Clinical management factors contribute to the decision for contralateral prophylactic mastectomy［J］．J Clin Oncol，2011，29（16）：2158－64．

［10］Levanat S，Cvok M L．Molecular basis of breast cancer related to BRCA1 and BRCA2 genes：characteristics and targeting therapy［J］．Lijec Vjesn，2010，132（1－2）：34－7．

［11］杨云振，余建军，余 辉，等．汉族散发性乳腺癌患者BRCA1基因突变研究［J］．宁夏医学杂志，2010，32（2）：108－10．

BRCA1 mutations in patients with triple negative breast cancer in multi-ethnic region of Xinjiang

Liu Xiaodan，Wu Tao，Du Lu，et al

（Dept of Surgery of Breast，Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011）

Abstract：ObjectiveTo analyze the prevalence of BRCA1 mutations in patients with triple negative breast cancer（TNBC）in multi-ethnic region of Xinjiang and to discuss the difference of clinical and pathological features between patients with BRCA1 gene mutation and without it．Methods BRCA1 mutations in 130 TNBC cases were detected by PCR-DNA sequencing．Genomic DNA was extracted from blood，and BRCA1 mutations were detectedby combined use of PCR and direct sequencing．Results The prevalence of BRCA1 mutations in 130 TNBC cases was 17．7%（23／130）．There was no statistically significant difference in prevalence of BRCA1 mutations between Han（20．5%，17／83）and minority cases（12．8%，6／47）（χ2＝1．856，P＝0．869）．There had been 23 cases of BRCA1 mutations with 19 loci in 130 cases of TNBC patients，8 of which were new loci．4 BRCA1 gene mutation＂hot spots＂were found．In addition，9 cases of pathogenic mutations（6．9%，9／130），including 5 cases of nonsense mutations，4 cases of frameshift mutations．The prevalence of BRCA1 mutations in 46 early onset breast cancer cases was 28．3%（13／46），which was higher than that in the late onset group（11．9%，10／84），and the difference was statistically significant（χ2＝5．460，P＜0．05）．Compared with patients without BRCA1 mutations，who with it had earlier age of onset，higher rate of axillary lymph node metastasis and later of TNM stage，the differences were statistically significant（P＜0．05）．Conclusion The prevalence of BRCA1 mutations in patients with TNBC is higher in multi-ethnic region of Xinjiang．Differences exist in clinical and pathological features between patients with BRCA1 gene mutation and without it．

Key words：TNBC；BRCA1 genes；mutation；DNA sequence analysis；clinical pathological features

中图分类号：R 737．9

文献标志码：A

文章编号：1000－1492（2015）03－0376－05

2014－12－10接收

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2012211A031）

作者单位：新疆医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，乌鲁木齐 830011

作者简介：刘晓丹，女，硕士研究生；朱丽萍，女，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：zlp＿1005＠sina．com

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